FastKing RT Kit (gDNase ilə)

A-1 RNT pozulur

—Çirklənmədən yüksək keyfiyyətli RNT -ni təmizləyin. RNT -nin çıxarıldığı material, RNT parçalanmasının qarşısını almaq üçün mümkün qədər təzə olmalıdır. RT reaksiyasından əvvəl denaturasiya edilmiş gel üzərində RNT bütövlüyünü təhlil edin. RNT çıxarılmasından sonra 100% formamiddə saxlanılmalıdır. RNaz inhibitoru istifadə edilərsə, qızdırma temperaturu <45 ° C, pH 8.0 -dan aşağı olmalıdır, əks halda inhibitor bütün bağlı RNazı sərbəst buraxacaq. Bundan əlavə, 0,8 mM DTT ehtiva edən məhlullara RNase inhibitoru əlavə edilməlidir.

A-2 RNT, əks transkripsiya reaksiyalarının inhibitorlarını ehtiva edir

—Ters transkripsiya inhibitorlarına SDS, EDTA, qliserol, natrium pirofosfat, spermidin, formamid, guanidin duzu və s. Daxildir. Nəzarət olunan RNT -ni nümunə ilə qarışdırın və bir inhibitor olub -olmadığını yoxlamaq üçün məhsuldarlığı nəzarət RNT reaksiyası ilə müqayisə edin. İnhibitorları çıxarmaq üçün RNA çökməsini 70% (v/v) etanol ilə yuyun.

A-3 cDNA-nın birinci zolağını sintez etmək üçün istifadə olunan astarların kifayət qədər tavlanmaması

——Yağlama temperaturunun təcrübədə istifadə olunan astarlar üçün uyğun olduğunu təyin edin. Təsadüfi hexamerlər üçün, reaksiya istiliyinə çatmadan əvvəl temperaturu 25 ° C -də 10 dəqiqə saxlamaq məsləhət görülür. Genə xas olan primerlər (GSP) üçün başqa GSP sınayın və ya oligo (dT) və ya təsadüfi hexamerə keçin.

A-4 Az miqdarda başlanğıc RNT

- RNT miqdarını artırın. 50 ng -dən az olan RNT nümunələri üçün, ilk zolaq cDNA sintezində 0.1 μg ilə 0.5 μg asetil BSA istifadə edilə bilər.

A-5 Hədəf ardıcıllığı analiz edilən toxumalarda ifadə olunmur.

—— Digər toxumaları sınayın.

A-6 PCR reaksiyası uğursuz olur

—- İki mərhələli RT-PCR üçün, PCR mərhələsindəki cDNA şablonu reaksiya həcminin 1/5 hissəsini keçə bilməz.

A-1 Astar və şablonların spesifik olmayan tavlanması

——3-uclu primerlərdə 2-3 dG və ya dC olmamalıdır. İlk iplik sintezində təsadüfi primerlər və ya oligo (dT) əvəzinə Genə aid primerlərdən istifadə edin. İlk bir neçə dövrədə daha yüksək tavlama temperaturu və sonra daha aşağı tavlama temperaturu istifadə edin. Reaksiyanın spesifikliyini yaxşılaşdırmaq üçün PCR üçün isti başlanğıc Taq DNA polimerazından istifadə edin.

A-2 Genə xas olan primerlərin zəif dizaynı

Astar dizaynını gücləndirmək üçün eyni prinsiplərə əməl edin.

Genomik DNT ilə çirklənmiş A-3 RNT

—RNT-ni PCR dərəcəli DNase I. ilə müalicə edin.

A-4 Astar dimerinin əmələ gəlməsi

- 3 -cü hissənin tamamlayıcı ardıcıllığı olmayan astarlar dizayn edin.

A-5 Çox yüksək Mg²⁺ konsentrasiya

Mg -ni optimallaşdırın²⁺ hər şablon və astar birləşməsi üçün konsentrasiya

A-6 Xarici DNT ilə çirklənmişdir

-Aerosola davamlı ipuçları və UDG fermentlərindən istifadə edin.

A-1 İlk iplik məhsulunun tərkibi çox yüksəkdir

--- Ənənəvi PCR reaksiya addımında ilk iplik məhsulunun miqdarını azaldın.

A-2 PCR reaksiyasında çox yüksək primer miqdarı

--— Astar girişini azaldın.

A-3 Çox çox dövr

PCR reaksiya şərtlərini optimallaşdırın və PCR dövrü sayını azaldın.

A-4 Çox aşağı tavlama temperaturu

Qeyri-spesifik başlanğıc və uzanmanın qarşısını almaq üçün tavlama temperaturunu artırın.

A-5 DNT-nin DNaz parçalanması nəticəsində əmələ gələn oligonükleotid parçalarının qeyri-spesifik gücləndirilməsi-DNT-nin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün yüksək keyfiyyətli RNT çıxarın.

RT-PCR, RNA-nı cDNA-ya geri çevirmək və sonra hədəf parçasını gücləndirmək üçün PCR reaksiyası üçün şablon olaraq tərsinə köçürülmüş cDNA-dan istifadə etməkdir. Təcrübənin xüsusi şərtlərinə uyğun olaraq təsadüfi primerləri, Oligo dT və genə xüsusi primerləri seçin. Yuxarıdakı bütün primerlər, saç tokası quruluşu olmayan qısa eukaryotik hüceyrə mRNA üçün istifadə edilə bilər.

Təsadüfi astar: Ring, mRNA, tRNA, və s.

Oligo dT: PolyA tullantıları olan RNT üçün uyğundur (prokaryotik RNT, eukaryotik Oligo dT rRNA və tRNA -da PolyA quyruqları yoxdur). Oligo dT PolyA quyruğuna bağlandığından, RNT nümunələrinin keyfiyyətinin yüksək olması tələb olunur və hətta az miqdarda parçalanma cDNA sintezinin miqdarını xeyli azaldır.

Genə xas primer: Şablon ardıcıllığını tamamlayır, hədəf ardıcıllığının məlum olduğu vəziyyətlərə uyğundur.

İki yol var:

1. Daxili istinad metodu: Teorik olaraq, cDNA fərqli uzunluqdakı DNT parçalarıdır, buna görə də elektroforezin nəticəsi smeardır. RNT bolluğu aşağı olarsa, heç bir məhsul elektroforezdə göstərilməyəcək, lakin bu heç bir məhsulun PCR ilə gücləndirilməyəcəyi anlamına gəlmir. Ümumiyyətlə, daxili istinad cDNA aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər. Daxili arayışın nəticələri varsa, cDNA -nın keyfiyyətinə əsasən zəmanət verilə bilər (bəzi hallarda, hədəf gen fraqmenti çox uzundursa, istisnalar ola bilər).

2. Bu şablonla gücləndirilmiş məlum bir gen varsa, bu genin primerləri tərəfindən təsdiqlənə bilər. Daxili istinadın gücləndirilməsi cDNA ilə heç bir problem olmadığı anlamına gəlmir. Daxili arayış cDNA -da yüksək miqdarda olduğu üçün gücləndirmək asandır. CDNA müxtəlif səbəblərdən qismən pozulursa, ehtimal baxımından, aşağı bolluğun hədəf genlərinin PCR nəticələri çox təsirlənəcəkdir. Daxili arayış hələ də bol olsa da, amplifikasiyaya təsir etməyəcək.

RNT -nin qismən parçalanması. RNT -nin bütövlüyünü aşkar edin və təmizləyin

Fərqli növlərin RNT tərkibi fərqli ola bilər, amma ümumiyyətlə, çıxarılan ümumi RNT -də gel elektroforezində iki aydın 28S və 18S bantları olmalı və əvvəlki bandın parlaqlığı ikincisindən iki qat yüksək olmalıdır. 5S diapazonu, RNT -nin pozulduğunu və parlaqlığının pozulma dərəcəsi ilə mütənasib olduğunu göstərir. Daxili istinadın uğurla gücləndirilməsi, RNT ilə bağlı heç bir problem olmadığı anlamına gəlmir, çünki daxili istinad çox yüksəkdir, tənəzzül şiddətli olmadığı müddətdə RNT gücləndirilə bilər. OD₂₆₀/OD₂₈₀Spektrofotometrlə ölçülmüş təmiz RNT nisbəti 1.9 ilə 2.1 arasında olmalıdır. RNT -dəki az miqdarda protein çirkləri nisbəti azaldacaq. Dəyər çox aşağı olmadığı müddətdə RT təsir etməyəcək. RT üçün ən vacib olan RNT bütövlüyüdür.

Daxili istinad geninin uzadılması yalnız RT -nin müvəffəqiyyətli olduğunu göstərə bilər, lakin bu mütləq cDNA telinin keyfiyyəti ilə əlaqəli deyil. Daxili istinad fraqmentləri ümumiyyətlə kiçik ölçüdə və ifadə baxımından yüksək olduğu üçün tərs transkripsiyada müvəffəqiyyətli olmaq daha asandır. Bununla birlikdə, hədəf genin ölçüsü və ifadəsi gendən genə dəyişir. CDNA keyfiyyəti yalnız 2 kb -dən çox olan hədəf parçaları üçün yalnız daxili istinadla qiymətləndirilə bilməz.

Bəzi nümunələr mürəkkəb ikincil quruluşa malikdir və ya zəngin GC tərkibinə malikdir və ya aşağı bolluqla qiymətlidir. Bu hallarda, hədəf fraqmentinin və nümunənin ölçüsünə görə uyğun tərs transkriptaza seçilməlidir. Yüksək GC məzmunlu və kompleks ikincil quruluşlu RNA şablonları üçün ikincil quruluşu aşağı temperaturda və ya ümumi tərs transkriptaza ilə açmaq çətindir. Bu şablonlar üçün, Quant Reverse Transcriptase seçilə bilər, çünki tərs transkripsiya performansı, müxtəlif RNA şablonlarını səmərəli şəkildə geri çevirə bilən və RNA-nı maksimum dərəcədə cDNA-nın birinci zolağına köçürə bilən M-MLV seriyalı tərs transkriptazdan daha yaxşı olduğu üçün açıqdır. Ümumi tərs transkriptaz dəstindən istifadə edərkən, 20 μl sistem yalnız 1 μg ümumi RNT -ni effektiv şəkildə geri çevirə bilər. Zəhmət olmasa, dəstin maksimum RT tutumuna diqqət yetirin. Şablon həddindən artıq əlavə olunarsa, əks transkripsiya yüksək bolluqla RNT -yə üstünlük verəcəkdir. Buna görə sistemin maksimum tutumunu aşmamaq daha yaxşıdır.

A-1 RNT-nin ciddi şəkildə parçalandığını və RT-nin müvəffəqiyyətli olub olmadığını təyin edin

Ümumiyyətlə, daxili istinad amplifikasiyasının uğursuzluğunun səbəbi çox vaxt ciddi RNT pozulmasından qaynaqlanır. Başqa bir səbəb tərs transkripsiya uğursuzluğudur. Daxili istinad cDNA tək telinin keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün standart olaraq istifadə edilə bilməz, ancaq RNT keyfiyyətində heç bir problem olmadıqda tərs transkripsiyanın müvəffəqiyyətli olub olmadığını mühakimə etmək üçün standart olaraq istifadə edilə bilər. Əks transkripsiya prosesində ən vacib şey, reaksiya səmərəliliyini artırmaq üçün sabit bir temperatur və sabit bir reaksiya sistemini qorumaqdır.

A-2 Daxili istinad genlərinin gücləndirilməsi üçün primerlərin etibarlı olub olmadığını və PCR-də istifadə olunan reaktivlərlə bağlı hər hansı bir problemin olub olmadığını müəyyənləşdirin.

Nisbi kəmiyyət üçün RNA, əks transkripsiyadan əvvəl ölçülməlidir, bu da bir çox tərs transkripsiya dəstlərində tələb olunur, məsələn, RNT girişini 1 μg olaraq ölçün. Əks transkripsiyalı cDNA, RNT, oligo dT, enzim, dNTP və hətta kiçik bir DNT qalıqları da daxil olmaqla qarışıq bir həll olduğundan, sapmaya səbəb olacaq, buna görə cDNA -nın dəqiq miqdarını təyin etmək mümkün deyil. Buna görə də, RNT kəmiyyətinin ölçülməsi zəruridir. Fərqli nümunələr arasında tərs transkripsiya səmərəliliyinin eyni olduğunu nəzərə alaraq, alınan cDNA miqdarı eyni olmalıdır və kəmiyyət təhlili eyni miqdarda ümumi RNT -də fərqli genlərin ifadə səviyyələrinin müqayisəsini göstərə bilər. Nisbi flüoresan kəmiyyətli PCR apararkən, əks transkripsiyadan sonra kəmiyyət cDNA tələb olunmaya bilər, çünki daxili istinad geni istinad kimi çıxış edə bilər.

Əsasən genlərlə əlaqədardır və uzun fraqmentin tərs transkripsiyası əksər genlər üçün mümkün deyil. Birincisi, tərs transkripsiya səmərəliliyi PCR -dən çox aşağıdır. İkincisi, GC zəngin bölgəsi və bir çox genin ikincil quruluşu həm tərs transkripsiyanı, həm də PCR -ni məhdudlaşdırır. Nəhayət, PCR -in sədaqət və gücləndirmə səmərəliliyinə eyni zamanda zəmanət vermək çətindir. Əks transkripsiya prosesində heç kim, xüsusən oligo dT istifadə edərək, aşağı nüsxəli genlər üçün uzun fraqment əldə etməyi təmin edə bilməz. Daha çox GC ilə 5 'UTR -ə gəlincə, daha da çətindir. Buna görə də, təsadüfi primerlərlə transkripsiyanı geri çevirmək, hədəf parçasında təbii parçalanma yerlərini tapmaq, seqmentlərlə gücləndirmək və sonra məhdudlaşdırma həzmini və bağlamanı yerinə yetirmək hələ də ağlabatan bir üsuldur. Ümumiyyətlə, 2 kb -dan böyük olan parçaları birbaşa gücləndirmək çətindir, lakin əldə etmək həmişə mümkün olmur: 1. Hər şeydən əvvəl RNT/mRNA -nın bütövlüyünü təmin edin və TRIZOL ekstraksiyasına üstünlük verilir. 2.M-MLV RT-PCR dəsti birbaşa istifadə edilə bilər. Tənzimləmə müddətini uzadın və amplifikasiya prosesində dövrün sayını düzgün şəkildə artırın. Alternativ olaraq, daxili PCR tətbiq oluna bilər və ya parçaların uzanmasına kömək edə biləcək normal PCR amplifikasiyasından əvvəl müvafiq olaraq uzadılmış denaturasiya və uzadılma müddəti ilə bir və ya iki reaksiya həyata keçirilə bilər. Polimerazın sədaqətinə diqqət yetirin. 3. Long Taq ideal nəticələr əldə etmək üçün PCR -də istifadə edilə bilər. 4. Protein ifadəsi üçün yüksək sədaqətli polimeraz tətbiq olunmalıdır.

TIANGEN tərəfindən təklif olunan iki növ tərs transkriptaz var: Quant/King RTase və TIANScript M-MLV. Aralarındakı əsas fərq, şablonların daxil edilməsidir. Quant, Moloney murin lösemi virusundan əldə edilən M-MLV-dən fərqli olan bənzərsiz tərs transkriptazdır. Quant, Escherichia coli mühəndisliyi tərəfindən rekombinant şəkildə ifadə edilən yeni yüksək səmərəli tərs transkriptazadır. Quant, yüksək tərs transkripsiya aktivliyi və yüksək məhsuldarlığı olan 50 ng-2 μg RNT-ni gücləndirmək üçün uygundur. Adi MMLV və ya AMV ilə müqayisədə Quant'ın ən böyük xüsusiyyəti, RNA şablonları ilə çox güclü bir yaxınlığa sahib olması və yüksək temperatur denaturasiyası olmadan transkripsiya kompleks şablonlarını tərsinə çevirə bilməsidir. Daha yüksək GC məzmunlu şablonlar üçün tərs səmərəlilik daha yüksəkdir. Bununla birlikdə, bu tərs transkriptazanın cDNA məhsulunun uzunluğunu təsir edə bilən RNase H aktivliyi vardır (<4.5 kb şablonlar üçün uyğundur). Adi tərs transkripsiya üçün TIANScript MMLV tərs transkriptaza tövsiyə olunur. Bu RTase, uzun (> 5 kb) cDNA sintezi üçün uyğun olan çox zəif RNase H aktivliyinə malik dəyişdirilmiş bir fermentdir.

Bir addım tərs transkripsiya və PCR amplifikasiyası, çirklənməni azaltmağa kömək edən cDNA sintezi ilə amplifikasiya arasındakı boru qapağı açılmadan eyni tüpdə tamamlanır. Əldə edilən bütün cDNA nümunələri amplifikasiya üçün istifadə edildiyindən, həssaslıq daha yüksəkdir, minimum 0.01 pg ümumi RNT. Uğurlu bir addımlı RTPCR üçün, genə xas olan primerlər ümumiyyətlə cDNA sintezini başlatmaq üçün istifadə olunur. İki addımlı metod, yəni tərs transkripsiya və PCR gücləndirmə iki mərhələdə həyata keçirilir. Əvvəlcə tərs transkripsiya cDNA əldə etmək üçün bir RNT şablonundan aparılır və əldə edilən cDNA bir və ya bir neçə fərqli PCR reaksiyasına məruz qalır. İki addımlı metod, cDNA-nın ilk zolağının sintezini istiqamətləndirmək üçün oligo (dT) və ya təsadüfi primerlərdən istifadə edə bilər və bütün mRNA məlumatlarını müəyyən bir nümunədən tərsinə çevirə bilər.