TIANSeq Fragment/Repair/Tailing Modulu

Hazırda yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı texnologiyası əsasən yeni nəsil sıralama texnologiyasına əsaslanır. Növbəti nəsil sıralama texnologiyasının oxu uzunluğu məhdud olduğu üçün tam uzunluq ardıcıllığını kiçik fraqment kitabxanalarına bölmək lazımdır. Fərqli ardıcıllıq təcrübələrinin ehtiyaclarına görə, adətən tək uçlu və ya ikiqat ardıcıllıqla seçirik. Hal-hazırda yeni nəsil sıralama kitabxanasının DNT parçaları ümumiyyətlə 200-800 bp aralığında paylanır.

a) DNT keyfiyyətsizdir və tərkibində inhibitorlar var. Ferment aktivliyinin inhibə edilməməsi üçün yüksək keyfiyyətli DNT nümunələrindən istifadə edin.

b) DNT kitabxanası qurmaq üçün PCR-free metodundan istifadə edərkən DNT nümunəsinin miqdarı kifayət deyil. Parçalanmış DNT-nin girişi 50 ng-dən artıq olduqda, kitabxana qurulması prosesində PCR-olmadan iş axını seçici şəkildə həyata keçirilə bilər. Kitabxananın nüsxə sayı çox azdırsa, ardıcıl olaraq sıralana bilmirsə, adapter bağlandıqdan sonra DNT kitabxanası PCR ilə gücləndirilə bilər.

c) RNT çirklənməsi qeyri -dəqiq ilkin DNT ölçüsünə səbəb olur Genomik DNT -nin təmizlənməsi prosesində RNT -nin çirklənməsi ola bilər ki, bu da qeyri -dəqiq DNT kəmiyyətinin təyin olunmasına və kitabxana tikintisi zamanı kifayət qədər DNT yüklənməsinə səbəb ola bilər. RNT, RNase ilə müalicə edilərək çıxarıla bilər.

A-1

a) Kiçik fraqmentlər görünür (60 bp-120 bp) Agencourt AMPure XP maqnit boncukları ilə təmizlənmə bu adapter parçalarını təsirli şəkildə aradan qaldıra bilər və sıralama keyfiyyətini təmin edə bilər.

b) PCR gücləndirilməsindən sonra kitabxanada böyük fraqmentlər görünür Adapter bağlandıqdan sonra kitabxana DNT parçasının ölçüsü 120 bp artacaq. Adapter bağlandıqdan sonra DNT parçası 120 bp -dən çox artarsa, bunun səbəbi həddindən artıq PCR amplifikasiyasının qeyri -adi fraqment amplifikasiyası ola bilər. PCR dövrlərinin sayının azaldılması vəziyyətin qarşısını ala bilər.

c) Adapter bağlandıqdan sonra kitabxana DNT fraqmentlərinin anormal ölçüsü Bu dəstdəki adapterin uzunluğu 60 bp -dir. Parçanın iki ucu adapterlərə bağlandıqda uzunluq yalnız 120 bp artacaq. Bu dəst tərəfindən veriləndən başqa bir adapter istifadə edərkən, adapterin uzunluğu kimi müvafiq məlumat vermək üçün təchizatçı ilə əlaqə saxlayın. Zəhmət olmasa təcrübənin iş axınının və əməliyyatının təlimatda təsvir olunan addımları izlədiyinə əmin olun.

d) Adaptör bağlamadan əvvəl anormal DNT parçasının ölçüsü Bu problemin səbəbi, DNT parçalanması zamanı səhv reaksiya şərtlərindən qaynaqlana bilər. Fərqli DNT girişi üçün fərqli reaksiya vaxtlarından istifadə edilməlidir. DNT girişi 10 ng-dən çoxdursa, optimallaşdırmanın başlanğıc vaxtı olaraq 12 dəqiqəlik reaksiya müddətini seçməyi məsləhət görürük və bu zaman istehsal olunan fraqment ölçüsü əsasən 300-500 bp aralığındadır. İstifadəçilər, DNT parçalarını lazımi ölçüdə optimallaşdırmaq üçün öz tələblərinə uyğun olaraq 2-4 dəqiqə müddətində artıra və ya azalda bilərlər.

A-2

a) Parçalanma vaxtı optimallaşdırılmır Əgər parçalanmış DNT çox kiçik və ya çox böyükdürsə, reaksiya müddətini təyin etmək üçün təlimatda verilən Parçalanma Zamanı Seçim Təlimatlarına baxın və bu zaman nöqtəsini nəzarət olaraq istifadə edin. parçalanma müddətini daha dəqiq tənzimləmək üçün reaksiya sistemini 3 dəqiqə uzatmaq və ya qısaltmaq.

A-3

Parçalanma müalicəsindən sonra DNT -nin anormal ölçülü paylanması

a) Parçalanma reagentinin yanlış ərimə üsulu və ya əridildikdən sonra reagent tamamilə qarışdırılmır. Buz üzərində 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagentini əridin. Çözüldükdən sonra borunun dibini yumşaq bir şəkildə vuraraq reagenti bərabər şəkildə qarışdırın. Reaktifi vorteks etməyin!

b) DNT giriş nümunəsində EDTA və ya digər çirkləndiricilər var DNT təmizləmə mərhələsində duz ionlarının və şelatlaşdırıcı maddələrin tükənməsi təcrübənin müvəffəqiyyəti üçün xüsusilə vacibdir. DNT 1 × TE -də həll edilərsə, parçalanmanı həyata keçirmək üçün təlimatda göstərilən metoddan istifadə edin. Solüsyonda EDTA konsentrasiyası qeyri -müəyyən olarsa, sonrakı reaksiya üçün DNT -ni təmizləmək və deionlaşdırılmış suda həll etmək məsləhət görülür.

c) Qeyri -dəqiq ilkin DNT miqdarı Parçalanmış DNT -nin ölçüsü DNT girişinin miqdarı ilə sıx bağlıdır. Parçalanma müalicəsindən əvvəl, Qubit, Picogreen və digər metodlardan istifadə edərək DNT -nin dəqiq ölçülməsi reaksiya sistemindəki DNT -nin dəqiq miqdarını təyin etmək üçün vacibdir.

 d) Reaksiya sisteminin hazırlanması təlimata uyğun gəlmir Parçalanmış reaksiya sisteminin hazırlanması ciddi şəkildə təlimatlara uyğun olaraq buz üzərində aparılmalıdır. Ən yaxşı təsiri təmin etmək üçün bütün reaksiya komponentləri buzun üzərinə qoyulmalı və tam soyuduqdan sonra reaksiya sisteminin hazırlanması aparılmalıdır. Hazırlıq tamamlandıqdan sonra hərtərəfli qarışdırmaq üçün çırpın və ya pipetlə sürün. Vorteks etməyin!

1. Yanlış qarışdırma metodu (burulğan, şiddətli salınım və s.) Kitabxana parçalarının anormal paylanmasına səbəb olacaq (aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi) və beləliklə kitabxananın keyfiyyətinə təsir edəcək. Buna görə də, Fragmentation Mix reaksiya həllini hazırlayarkən, qarışdırmaq üçün yuxarıya və aşağıya yumşaq bir şəkildə pipet vurun və ya barmaqlarınızın ucundan istifadə edərək bərabər şəkildə qarışdırın. Vortekslə qarışdırmamaq üçün diqqətli olun.

2. Kitabxana tikintisi üçün yüksək təmizlikdə olan DNT -dən istifadə edilməlidir

■ Yaxşı DNT bütövlüyü: Elektroforez bandı 30 kb -dən çoxdur, heç bir quyruğu yoxdur

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. DNT giriş miqdarı dəqiq olmalıdır DNT -ni ölçmək üçün Nanodropdan daha çox Qubit və PicoGreen metodlarından istifadə etmək tövsiyə olunur.

4. DNA həllində EDTA -nın tərkibi müəyyən edilməlidir EDTA -nın parçalanma reaksiyasına böyük təsiri vardır. EDTA məzmunu yüksəkdirsə, sonrakı testdən əvvəl DNT təmizlənməsi aparılmalıdır.

5. Parçalanma reaksiya məhlulu buz üzərində hazırlanmalıdır. Parçalanma prosesi reaksiya temperaturuna və vaxtına həssasdır (xüsusən gücləndirici əlavə etdikdən sonra). Reaksiya vaxtının düzgünlüyünü təmin etmək üçün, buz üzərində reaksiya sistemi hazırlayın.

6. Parçalanma reaksiya müddəti dəqiq olmalıdır Parçalanma mərhələsinin reaksiya müddəti, parçalanmış məhsulların ölçüsünə birbaşa təsir edəcək və beləliklə kitabxanadakı DNT parçalarının ölçü payına təsir edəcək.

1. Bu dəstə hansı nümunə tətbiq olunur?

Bu dəstin tətbiq olunan nümunə növü, ümumi RNT və ya yaxşı RNA bütövlüyü ilə təmizlənmiş mRNA ola bilər. Kitabxananın qurulması üçün ümumi RNT istifadə olunursa, əvvəlcə rRNA -nı çıxarmaq üçün rRNA tükəndirmə dəstindən (Cat#4992363/4992364/4992391) istifadə etmək tövsiyə olunur.

2. FFPE nümunələri bu kitlə kitabxana qurmaq üçün istifadə edilə bilərmi?

FFPE nümunələrindəki mRNA nisbətən zəif bütövlüklə müəyyən dərəcədə pozulacaq. Kitabxananın tikintisi üçün bu dəstdən istifadə edərkən parçalanma müddətini optimallaşdırmaq məsləhət görülür (parçalanma müddətini qısaltmaq və ya parçalamamaq).

3. Məhsul təlimatında göstərilən ölçü seçimi addımından istifadə edərək, daxil edilmiş seqmentin kiçik bir sapma görünməsinə nə səbəb ola bilər?

Ölçü seçimi bu məhsul təlimatında ölçü seçimi mərhələsinə uyğun olaraq həyata keçirilməlidir. Sapma varsa, bunun səbəbi maqnit boncuklarının otaq istiliyinə balanslaşdırılmaması və ya tam qarışdırılmaması, pipetin dəqiq olmaması və ya mayenin ucunda qalması ola bilər. Təcrübə üçün aşağı adsorbsiyalı ipuçlarından istifadə etmək tövsiyə olunur.

4. Kitabxana tikintisində adapterlərin seçilməsi

Kitabxana tikinti dəstində adapter reaktivi yoxdur və bu dəsti TIANSeq Tək İndeksli Adapter (Illumina) ilə birlikdə istifadə etmək tövsiyə olunur (4992641/4992642/4992378).

5. Kitabxananın keyfiyyət göstəriciləri

Kitabxananın kəmiyyət aşkarlanması: Qubit və qPCR, kitabxananın kütlə konsentrasiyasını və molar konsentrasiyasını təyin etmək üçün istifadə olunur. Əməliyyat ciddi şəkildə məhsul təlimatına uyğun aparılır. Kitabxananın konsentrasiyası ümumiyyətlə NGS sıralamasının tələblərinə cavab verəcəkdir. Kitabxana paylama aralığının algılanması: Kitabxana paylama aralığını aşkar etmək üçün Agilent 2100 Bioanalyzer istifadə edin.

6. Gücləndirmə dövrü nömrəsinin seçilməsi

Təlimatlara görə, PCR dövrlərinin sayı 6-12 arasındadır və lazım olan PCR dövrü sayı nümunə girişinə görə seçilməlidir. Yüksək məhsuldarlıq olan kitabxanalarda, həddindən artıq güclənmə ümumiyyətlə müxtəlif dərəcələrdə baş verir ki, bu da Agilent 2100 Bioanalyzerin aşkarlanmasında hədəf aralığının zirvəsindən sonra bir az daha böyük pik ilə özünü göstərir və ya Qubitin aşkar edilmiş konsentrasiyası qPCR-dən daha aşağıdır. Yüngül amplifikasiya, kitabxana sıralamasına və sonrakı məlumatların analizinə təsir etməyən normal bir fenomendir.

7. Tırmanışlar Agilent 2100 Bioanalyzerin aşkarlama profilində görünür

Agilent 2100 Bioanalyzer aşkarlanmasında sünbüllərin görünüşü, nümunələrin qeyri -bərabər parçalanmasından qaynaqlanır, burada müəyyən ölçüdə daha çox fraqment olacaq və bu, PCR zənginləşdirilməsindən sonra daha aydın görünəcək. Bu halda, ölçü seçiminin edilməməsi, yəni parçalanma vəziyyətinin kiçik olduğu və konsentrasiyası olduğu 15 dəqiqə inkübe edildikdə 94 ° C -ə qoyulması və homojenliyin yaxşılaşdırıla biləcəyi təklif olunur.