Qan birbaşa PCR dəsti

Qanı çıxarılmadan şablon olaraq birbaşa istifadə edərək hədəf genin sürətli şəkildə gücləndirilməsi.

Bu kit insan genomundakı tək nüsxəli genləri səmərəli şəkildə gücləndirmək üçün genetik olaraq hazırlanmış anti-inhibitor DNT polimerazı qəbul edir. Bu dəstdəki yaxşı optimallaşdırılmış tampon sistemi, polimeraza PCR inhibitorlarının inhibisyonuna güclü müqavimət göstərməsinə kömək edir, beləliklə şablon olaraq qan və mədəni hüceyrələrdən istifadə edərək DNT -ni birbaşa gücləndirə bilər. Bu məhsulun istifadəsi asandır və DNT təmizlənməsi və ya nümunə əvvəlcədən təmizlənməsi kimi mürəkkəb addımlar tələb etmir.
Bu dəst 2 × MasterMix şəklində təqdim olunur və reaksiya sadəcə qan şablonu və müvafiq aşkarlama primerləri əlavə etməklə həyata keçirilə bilər. İnsanlar, siçanlar, donuzlar, iribuynuzlu heyvanlar və digər növlər kimi məməlilərin mədəni hüceyrələrinə, həmçinin təzə və ya 4 ℃ krio konservləşdirilmiş tam qan, antikoagulyant (EDTA, sitrat, heparin), mayeləşdirilmiş qan laxtaları və quru qan ləkələrinə tətbiq oluna bilər. Whatman 903 və FTA Elute ticarət kartlarında saxlanılır.

Pişik Yox	Qablaşdırma Ölçüsü
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Bizə e -poçt göndərin

Məhsul Detalları

Təcrübə nümunəsi

FAQ

Məhsul Etiketləri

Xüsusiyyətləri

■ Sadə və sürətli: Nümunə hazırlanması və DNT çıxarılması üçün yorucu addımlara ehtiyac olmadan, PCR gücləndirilməsi birbaşa şablon olaraq qandan istifadə etməklə həyata keçirilə bilər.
■ Yüksək təmizlik: Nümunə əvvəlcədən müalicə və DNT çıxarma addımlarının atlanması nümunələrin çarpaz çirklənməsinin qarşısını almağa kömək edə bilər.
■ Yüksək məhsuldarlıq: Böyük ölçülü nümunələr üçün PCR identifikasiyası, kiti 96/384 quyulu PCR lövhələri ilə birləşdirməklə həyata keçirilə bilər.
■ Güclü universallıq: Bu dəst yüksək GC parçalarını və ya kompleks ikincil quruluşlu parçaları səmərəli şəkildə gücləndirə bilər və gücləndirmə uzunluğu 5 kb -a qədər ola bilər.
■ Güclü stresə qarşı müqavimət: Bu dəst müxtəlif növlərdə saxlanılan müxtəlif növlər və qan nümunələri üçün tətbiq oluna bilər.

Tətbiqlər

Bu dəstin PCR məhsullarında, TA vektorunun klonlaşdırılması üçün birbaşa istifadə edilə bilən 3'ün sonunda "A" var. Bu dəst genomik DNT fraqmentlərinin gücləndirilməsi, yüksək məhsuldar genetik analiz və genotipləşdirmə (məsələn, gen aşkarlanması) analizi üçün istifadə edilə bilər.

Bütün məhsullar ODM/OEM üçün fərdiləşdirilə bilər. Ətraflı məlumat üçün,zəhmət olmasa Xüsusi Xidmətə (ODM/OEM) basın

Əvvəlki: TIANcombi DNA Lyse və Det PCR Kit

Sonrakı: Siçan toxuması birbaşa PCR dəsti

	Şablon olaraq insan EDTA antikoagulyasiyasından istifadə edərək, fərqli GC tərkibli 4 gen Blood Direct PCR Kit ilə gücləndirildi. PCR reaksiya sistemi 20 μl idi və şablon olaraq 1 μl qan istifadə edildi. M: TIANGEN Marker II; 1: Parça ölçüsü 1090 bp, GC tərkibi 68.1%; 2: Fragment ölçüsü 1915 bp, GC tərkibi 70.4%; 3: Parça ölçüsü 448 bp, GC tərkibi 74.8%; 4: Fraqment ölçüsü 1527 bp, GC tərkibi 61.5%. Eksperimental nəticələr: Blood Direct PCR Kit, GC məzmunu ilə 61.5%-74.8%aralığında DNT parçalarını təsirli şəkildə gücləndirə bilər və bu da yüksək GC parçalarını gücləndirə biləcəyini göstərir.
	Şablon olaraq insan EDTA antikoagulyasiyasından istifadə edərək, müxtəlif uzunluqlu 5 gen (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 və Hn4.0) Blood Direct PCR Kit ilə gücləndirildi. PCR reaksiya sistemi 20 μl idi və şablon olaraq 1 μl qan istifadə edildi. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 fərqli qan nümunəsi; NTC: astarsız nəzarət. Eksperimental nəticələr: Blood Direct PCR Kit, 4 kb uzunluğunda olan parçaları gücləndirə bilər ki, bu da uzun parçaları gücləndirə biləcəyini göstərir.
	Şablon olaraq insan EDTA antikoaqulyasiyasından istifadə edərək, müxtəlif qan nümunələrinin PCR aşkarlanması üçün Blood Direct PCR Kitindən istifadə edilmişdir. PCR reaksiya sistemi 20 μl idi və şablon olaraq 1 μl qan istifadə edildi. M: TIANGEN Marker II; 1-9: qanın yüklənmə miqdarı sırasıyla 0.1 μl, 0.2 μl, 0.3 μl, 0.4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl və 5 μl; NTC: şablon olmadan nəzarət Eksperimental nəticələr: Blood Direct PCR Kit qana güclü müqavimət göstərir və 0.1-5 μl yükləmə aralığında qan nümunələrini gücləndirə bilər.
	Şablon olaraq fərqli müalicə üsulları ilə insan, siçovul, toyuq və digər növlərdən alınan qan nümunələri istifadə edilmişdir. Blood Direct PCR Kit PRNP (insan, 750 at), Aktin (sıçan, 200 bp) və β-Aktini (Toyuq, 1.0 kb) gücləndirmək üçün istifadə edilmişdir. PCR reaksiya sistemi 20 μl idi və şablon olaraq 1 μl qan istifadə edildi. M: TIANGEN Marker II. Eksperimental nəticələr: Blood Direct PCR Kit geniş çeşidli nümunələrə tətbiq oluna bilər və fərqli müalicə üsulları olan müxtəlif növlərin qan nümunələrində birbaşa PCR aşkarlanması həyata keçirilə bilər.

S: Gücləndirici bantlar yoxdur

A-1 Şablon

■ Şablonda protein çirkləri və ya Taq inhibitorları və s. Var - DNT şablonunu təmizləyin, protein çirklərini çıxarın və ya təmizləyici dəstlərlə şablon DNT çıxarın.

■ Şablonun denaturasiyası tamamlanmadı ——Denaturasiya temperaturunu uyğun şəkildə artırın və denaturasiya müddətini uzatın.

■ Şablonun deqradasiyası-Şablonu yenidən hazırlayın.

A-2 astar

■ Astarların keyfiyyətsiz olması-Astarı yenidən sintez edin.

■ Astar deqradasiyası - Yüksək konsentrasiyalı astarları qorumaq üçün kiçik həcmdə ayırın. Çoxlu donma və ərimədən və ya uzun müddət 4 ° C temperaturda saxlamayın.

■ Astarların uyğun olmayan dizaynı (məsələn, astar uzunluğu kifayət deyil, astarlar arasında dimer əmələ gəlmişdir və s.)

A-3 Mq²⁺konsentrasiya

■ Mg²⁺ konsentrasiyası çox aşağıdır - Mg -ni mütəmadi olaraq artırın²⁺konsentrasiyası: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

A-4 Tavlama temperaturu

■ Yüksək tavlanma temperaturu astar və şablonun bağlanmasına təsir göstərir. ——Yandırma temperaturunu azaldın və vəziyyəti 2 ° C bir qradiyentlə optimallaşdırın.

A-5 Uzatma müddəti

■ Qısa uzatma müddəti —— Uzatma müddətini artırın.

S: Yalan pozitiv

Fenomenlər: Mənfi nümunələr hədəf ardıcıllıq zolaqlarını da göstərir.

A-1 PCR çirklənməsi

■ Hədəf ardıcıllığının və ya gücləndirmə məhsullarının çarpaz çirklənməsi - mənfi nümunədə hədəf ardıcıllığı olan nümunəni diqqətlə pipetləməyin və ya santrifüj borusundan tökməyin. Reaktivlər və ya avadanlıqlar mövcud nuklein turşularını aradan qaldırmaq üçün avtoklavlaşdırılmalı və çirklənmənin mövcudluğu mənfi nəzarət təcrübələri ilə müəyyən edilməlidir.

■ Reaktivlərin çirklənməsi - Reaktivləri çoxaldın və aşağı temperaturda saxlayın.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ konsentrasiyası çox aşağıdır - Mg -ni mütəmadi olaraq artırın²⁺ konsentrasiyası: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

■ Yanlış astar dizaynı və hədəf ardıcıllığı, hədəf olmayan ardıcıllıqla homologiyaya malikdir. —- Yenidən dizayn astarları.

S: Qeyri-spesifik gücləndirmə

Fenomenlər: PCR gücləndirmə bantları, istər böyük, istər kiçik, ya da bəzən hər iki spesifik gücləndirmə zolağı və qeyri-spesifik gücləndirmə zolağı meydana çıxması gözlənilən ölçü ilə uyğun gəlmir.

A-1 astar

■ Zəif primer spesifikliyi

—- Yenidən dizayn astarı.

■ Astar konsentrasiyası çox yüksəkdir - Denaturasiya temperaturunu düzgün şəkildə artırın və denaturasiya müddətini uzatın.

A-2 Mq²⁺ konsentrasiya

■ Mg²⁺ konsentrasiyası çox yüksəkdir - Mg2+ konsentrasiyasını düzgün şəkildə azaldın: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

A-3 Termostabil polimeraza

■ Həddindən artıq ferment miqdarı - Enzim miqdarını 0,5 U aralıqlarla uyğun olaraq azaldın.

A-4 Tavlama temperaturu

■ Tavlama temperaturu çox aşağıdır-Tava istiliyini uyğun şəkildə artırın və ya iki mərhələli tavlama üsulunu tətbiq edin

A-5 PCR dövrü

■ Çox PCR dövrü ——PZR dövrlərinin sayını azaldın.

S: Yamaq və ya ləkə bantları

A-1 astar—— Zəif spesifiklik —— Astarın yenidən dizaynı, spesifikliyini artırmaq üçün astarın mövqeyini və uzunluğunu dəyişdirin; ya da iç içə PCR aparın.

A-2 DNT şablonu

- Şablon təmiz deyil - Şablonu təmizləyin və ya DNT -ni təmizləmə dəstləri ilə çıxarın.

A-3 Mq²⁺ konsentrasiya

——Mg²⁺ konsentrasiyası çox yüksəkdir - Mg -ni düzgün şəkildə azaldır²⁺ konsentrasiyası: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

A-4 dNTP

- DNTP konsentrasiyası çox yüksəkdir - DNTP konsentrasiyasını müvafiq şəkildə azaldın

A-5 Tavlama temperaturu

——Çox aşağı tavlanma temperaturu ——Yuyulma temperaturunu uyğun şəkildə artırın

A-6 dövrü

——Çox çox dövr —Sikl sayını optimallaşdırın

S: 50 μl PCR reaksiya sisteminə nə qədər şablon DNT əlavə edilməlidir?

S: Uzun parçaları necə gücləndirmək olar?

İlk addım uyğun polimeraza seçməkdir. Daimi Taq polimeraz, 3'-5 'ekzonükleaz aktivliyinin olmaması səbəbindən yoxlanıla bilməz və uyğunsuzluq fraqmentlərin uzanma səmərəliliyini xeyli azaldacaq. Buna görə də, müntəzəm Taq polimerazası 5 kb -dan böyük hədəf parçalarını təsirli şəkildə gücləndirə bilməz. Xüsusi modifikasiyalı Taq polimeraz və ya digər yüksək sədaqətli polimeraz, genişləndirmə səmərəliliyini artırmaq və uzun fraqment gücləndirmə ehtiyaclarını ödəmək üçün seçilməlidir. Bundan əlavə, uzun fraqmentlərin gücləndirilməsi də astar dizaynının, denaturasiya müddətinin, uzadılma müddətinin, tampon pH-nın və s. Müvafiq tənzimləmə tələb edir. Adətən, 18-24 bp olan primerlər daha yaxşı məhsuldarlığa səbəb ola bilər. Şablonun zədələnməsinin qarşısını almaq üçün, 94 ° C -dəki denatürasiya müddəti dövr başına 30 saniyəyə və ya daha aza endirilməlidir və amplifikasiyadan əvvəl temperaturun 94 ° C -ə yüksəlmə müddəti 1 dəqiqədən az olmalıdır. Üstəlik, genişləndirmə temperaturunu təxminən 68 ° C -də təyin etmək və 1 kb/dəq nisbətinə görə uzadılma müddətini dizayn etmək uzun parçaların təsirli şəkildə gücləndirilməsini təmin edə bilər.

S: PCR -nin amplifikasiya sədaqətini necə artırmaq olar?

PCR amplifikasiyasının səhv dərəcəsi yüksək sədaqətlə müxtəlif DNT polimerazalar istifadə etməklə azaldıla bilər. İndiyə qədər tapılan bütün Taq DNA polimerazları arasında Pfu fermenti ən aşağı səhv nisbətinə və ən yüksək sədaqətə malikdir (əlavə olunmuş cədvələ baxın). Enzim seçiminə əlavə olaraq, tədqiqatçılar tampon tərkibini, termostabil polimeraz konsentrasiyasını və PCR dövrü sayını optimallaşdırmaq da daxil olmaqla reaksiya şərtlərini optimallaşdıraraq PCR mutasiya nisbətini daha da azalda bilər.

Mesajınızı bura yazın və bizə göndərin