Siçan toxuması birbaşa PCR dəsti

A-1 Şablon

■ Şablonda protein çirkləri və ya Taq inhibitorları və s. Var - DNT şablonunu təmizləyin, protein çirklərini çıxarın və ya təmizləyici dəstlərlə şablon DNT çıxarın.

■ Şablonun denaturasiyası tamamlanmadı ——Denaturasiya temperaturunu uyğun şəkildə artırın və denaturasiya müddətini uzatın.

■ Şablonun deqradasiyası-Şablonu yenidən hazırlayın.

A-2 astar

■ Astarların keyfiyyətsiz olması-Astarı yenidən sintez edin.

■ Astar deqradasiyası - Yüksək konsentrasiyalı astarları qorumaq üçün kiçik həcmdə ayırın. Çoxlu donma və ərimədən və ya uzun müddət 4 ° C temperaturda saxlamayın.

■ Astarların uyğun olmayan dizaynı (məsələn, astar uzunluğu kifayət deyil, astarlar arasında dimer əmələ gəlmişdir və s.)

A-3 Mq²⁺konsentrasiya

■ Mg²⁺ konsentrasiyası çox aşağıdır - Mg -ni mütəmadi olaraq artırın²⁺ konsentrasiyası: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

A-4 Tavlama temperaturu

■ Yüksək tavlanma temperaturu astar və şablonun bağlanmasına təsir göstərir. ——Yandırma temperaturunu azaldın və vəziyyəti 2 ° C bir qradiyentlə optimallaşdırın.

A-5 Uzatma müddəti

■ Qısa uzatma müddəti —— Uzatma müddətini artırın.

Fenomenlər: Mənfi nümunələr hədəf ardıcıllıq zolaqlarını da göstərir.

A-1 PCR çirklənməsi

■ Hədəf ardıcıllığının və ya gücləndirmə məhsullarının çarpaz çirklənməsi - mənfi nümunədə hədəf ardıcıllığı olan nümunəni diqqətlə pipetləməyin və ya santrifüj borusundan tökməyin. Reaktivlər və ya avadanlıqlar mövcud nuklein turşularını aradan qaldırmaq üçün avtoklavlaşdırılmalı və çirklənmənin mövcudluğu mənfi nəzarət təcrübələri ilə müəyyən edilməlidir.

■ Reaktivlərin çirklənməsi - Reaktivləri çoxaldın və aşağı temperaturda saxlayın.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ konsentrasiyası çox aşağıdır - Mg -ni mütəmadi olaraq artırın²⁺ konsentrasiyası: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

■ Yanlış astar dizaynı və hədəf ardıcıllığı, hədəf olmayan ardıcıllıqla homologiyaya malikdir. —- Yenidən dizayn astarları.

Fenomenlər: PCR gücləndirmə bantları, istər böyük, istər kiçik, ya da bəzən hər iki spesifik gücləndirmə zolağı və qeyri-spesifik gücləndirmə zolağı meydana çıxması gözlənilən ölçü ilə uyğun gəlmir.

A-1 astar

■ Zəif primer spesifikliyi

—- Yenidən dizayn astarı.

■ Astar konsentrasiyası çox yüksəkdir - Denaturasiya temperaturunu düzgün şəkildə artırın və denaturasiya müddətini uzatın.

A-2 Mq²⁺ konsentrasiya

■ Mg²⁺ konsentrasiyası çox yüksəkdir - Mg2+ konsentrasiyasını düzgün şəkildə azaldın: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

A-3 Termostabil polimeraza

■ Həddindən artıq ferment miqdarı - Enzim miqdarını 0,5 U aralıqlarla uyğun olaraq azaldın.

A-4 Tavlama temperaturu

■ Tavlama temperaturu çox aşağıdır-Tava istiliyini uyğun şəkildə artırın və ya iki mərhələli tavlama üsulunu tətbiq edin

A-5 PCR dövrü

■ Çox PCR dövrü ——PZR dövrlərinin sayını azaldın.

A-1 astar—— Zəif spesifiklik —— Astarın yenidən dizaynı, spesifikliyini artırmaq üçün astarın mövqeyini və uzunluğunu dəyişdirin; ya da iç içə PCR aparın.

A-2 DNT şablonu

- Şablon təmiz deyil - Şablonu təmizləyin və ya DNT -ni təmizləmə dəstləri ilə çıxarın.

A-3 Mq²⁺ konsentrasiya

——Mg²⁺ konsentrasiyası çox yüksəkdir - Mg -ni düzgün şəkildə azaldır²⁺ konsentrasiyası: Mg -ni optimallaşdırın²⁺ optimal Mg təyin etmək üçün 0,5 mM aralığında 1 mM -dən 3 mM -ə qədər olan bir sıra reaksiyalarla konsentrasiyası²⁺ hər şablon və astar üçün konsentrasiya.

A-4 dNTP

- DNTP konsentrasiyası çox yüksəkdir - DNTP konsentrasiyasını müvafiq şəkildə azaldın

A-5 Tavlama temperaturu

——Çox aşağı tavlanma temperaturu ——Yuyulma temperaturunu uyğun şəkildə artırın

A-6 dövrü

——Çox çox dövr —Sikl sayını optimallaşdırın

İlk addım uyğun polimeraza seçməkdir. Daimi Taq polimeraz, 3'-5 'ekzonükleaz aktivliyinin olmaması səbəbindən yoxlanıla bilməz və uyğunsuzluq fraqmentlərin uzanma səmərəliliyini xeyli azaldacaq. Buna görə də, müntəzəm Taq polimerazası 5 kb -dan böyük hədəf parçalarını təsirli şəkildə gücləndirə bilməz. Xüsusi modifikasiyalı Taq polimeraz və ya digər yüksək sədaqətli polimeraz, genişləndirmə səmərəliliyini artırmaq və uzun fraqment gücləndirmə ehtiyaclarını ödəmək üçün seçilməlidir. Bundan əlavə, uzun fraqmentlərin gücləndirilməsi də astar dizaynının, denaturasiya müddətinin, uzadılma müddətinin, tampon pH-nın və s. Müvafiq tənzimləmə tələb edir. Adətən, 18-24 bp olan primerlər daha yaxşı məhsuldarlığa səbəb ola bilər. Şablonun zədələnməsinin qarşısını almaq üçün, 94 ° C -dəki denatürasiya müddəti dövr başına 30 saniyəyə və ya daha aza endirilməlidir və amplifikasiyadan əvvəl temperaturun 94 ° C -ə yüksəlmə müddəti 1 dəqiqədən az olmalıdır. Üstəlik, genişləndirmə temperaturunu təxminən 68 ° C -də təyin etmək və 1 kb/dəq nisbətinə görə uzadılma müddətini dizayn etmək uzun parçaların təsirli şəkildə gücləndirilməsini təmin edə bilər.

PCR amplifikasiyasının səhv dərəcəsi yüksək sədaqətlə müxtəlif DNT polimerazalar istifadə etməklə azaldıla bilər. İndiyə qədər tapılan bütün Taq DNA polimerazları arasında Pfu fermenti ən aşağı səhv nisbətinə və ən yüksək sədaqətə malikdir (əlavə olunmuş cədvələ baxın). Enzim seçiminə əlavə olaraq, tədqiqatçılar tampon tərkibini, termostabil polimeraz konsentrasiyasını və PCR dövrü sayını optimallaşdırmaq da daxil olmaqla reaksiya şərtlərini optimallaşdıraraq PCR mutasiya nisbətini daha da azalda bilər.